Как работает вирус гриппа: почему мы болеем? Этапы и механизм процесса инфицирования и размножение вирусов Реакция торможения гемагглютинации

К. ШОЛТИССЕК и Х.-Д. КЛЕНК (СН. SCHOLTISSEK , H .-D . KLENK )

I. ВВЕДЕНИЕ

По проблеме репликации вируса гриппа существует ряд обзоров. Литература до 1968 г. обобщена в статьях Hoyle (1968) "и Scholtissek (1969); более поздними работами являются обзоры White (1973), а также Compans и Choppin (1974).

Большинство данных по репликации получено при "изучении вируса гриппа типа А. Существенных отличий в (Механизмах репликации других типов вируса гриппа пока не найдено.

Получило распространение несколько систем культур клеток, удобных для.изучения репликации, например размножение штамма WSN вируса гриппа в клетках MDBK (Choppin, 1969) или размножение вируса чумы птиц (FPV) в клетках фибробластов куриного эмбриона. Пример кривой роста последнего вируса в одиночном цикле доказан на 30, где латентный период равен примерно 3 ч и продукция вируса выходит на плато между 8 и 12 ч. Вообще в таких системах клеток наблюдается высокий выход инфекционного вируса, а синтез клеточных белков весьма эффективно подавляется после инфекции. Поэтому такие системы очень удобны для биохимических "исследований.

II. АДСОРБЦИЯ, ПРОНИКНОВЕНИЕ, «РАЗДЕВАНИЕ» ВИРУСА

Заражение клетки вирусом начинается с адсорбции, т. е. прикрепления вирусной частицы ж поверхности клетки. Для прикрепления необходимы две комплементарные структуры, а именно: рецепторные участки на "поверхности клетки и вирусный компонент, ответственный за узнавание этих рецеп-торных участков. В течение многих лет известна способность вируса гриппа взаимодействовать с эритроцитами различного происхождения и агглютинировать их (Hirst, 1941; McClelland, Hare, 1941). Гемагглютинация была использована как модельная реакция взаимодействия вируса гриппа с поверхностью клетки, и "большинство ваших знаний об этом явлении получено из подобных исследований. Однако следует быть очень осторожным в обобщениях, поскольку структуры -поверхности эритроцитов и поверхности инфицируемых клеток могут быть совершенно различными (см. также гл. 3).

А. РОЛЬ ГЕМАГГЛЮТИНИНА В АДСОРБЦИИ

Компонентом вириона, включающимся в связывание, является «шип» НА*. Роль вирусных -белков в инициации инфекции была изучена с использованием антител, специфичных к двум поверхностным белкам: НА* и NA*. Эти антитела могут быть получены при использовании рекомбинантных вирусов. Например, скрещивание между вирусами АО и А2 приводит к образованию рекомбинанта X7F1, который несет НА*, АО и NA* A2 (Kilbourne et al., 1968). Антисыворотка к вирусу X7F1 не ингибирует NA* вирусов гриппа типа АО, но ингибирует гемагглютинацию и нейтрализует инфекционность вирусов этого типа. Взаимодействие той же сыворотки с вирусами гриппа типа А2 не ингибирует гемагглютинации или инфекционности, хотя нейтрализация активности NA* при этом полная. Таким образом, NA* не включается в процесс инициации инфекции, и только НА*, до-видимому, ответствен за адсорбцию. Эта концепция подтверждается данными о том, что вирусные частицы, из которых протеолитическими ферментами удалены одни лишь нейраминидазные «шипы», оставались инфекционными (Schulze, 1970).

Имеются данные, что гемагглютинирующая часть локализована на внешней части «шипа» НА*, богатой углеводами (см. гл. 3). Углеводы, по-видимому, необходимы для функционирования НА*, поскольку негликозилированные белки НА* неспособны связываться с эритроцитами (Klenk et al., 1972b).

Б. РЕЦЕПТОР ВИРУСА ГРИППА

Углеводы являются существенным (компонентом не только гемагглютишина, но и вирусного рецептора на поверхности клетки. Hirst (1942) наблюдал, что ■комплекс вирус - эритроцит нестабилен и что рецептор на поверхности «летки разрушается ферментом вируса. Как было показано позднее, этим ферментом является нейраминидаза, отщепляющая нейрашшовую "кислоту от гликопротеинов (Klenk et al., 1955; Klenk, Stoffel, 1956; Gottschalk, 1957). Это было первой демонстрацией фермента, являющегося составной частью вирусной частицы. Бактериальные нейраминидазы также способны разрушать рецепторы вируса гриппа (Burnet, Stone, 1947). Таким образом, было установлено, что рецептор для вируса гриппа - это гликопротеин, содержащий нейрямино-вую кислоту.

С тех пор накоплено большое количество информации

о рецепторе миксовирусов, обобщенной недавно в обзоре

Hughes (1973). Кратко полученные данные сводятся к сле

дующему. Рецелторные участки содержат остатки нейрами-

иовой кислоты, которые присутствуют в углеводных цепях

гликопротеинов. Неокисляющиеся концевые остатки нейрами-

нознла необходимы для взаимодействия гликопротеидов с ви

русом гриппа. Обработка нейраминидазой полностью снимает

связывающую активность. Исследования по деградации с ис

пользованием перйодата предполагают, что для связывающей

активности необходима интактная молекула нейраминовой

кислоты (Suttajit, Winzler, 1971). Карбоксильная группа,

вероятно, также играет важную роль, поскольку необходимы,

по-видимому, и электростатические силы (Huang, 1974).

Представляется вероятным, что имеется лишь слабая специ

фичность относительно структуры, с которой связывается

нейраминовая кислота, поскольку, как было показано, целый

набор гликопротеинов, содержащих яейраминовую кислоту,

связывается с миксовирусами. Более того, ганглиозиды (гли-

ются активными в этом отношении (Haywood, 1975).

Можно надеяться, что вопрос связывания вируса гриппа прояснится в большей мере после установления молекулярной структуры рецептора. До некоторой степени это уже достигнуто в случае эритроцитов (Marchesi et al., 1973). Дополнительную информацию может также представить изучение прикрепления миксовируоов к искусственным мембранам (Tiffany, Blough, 1971).

В. ВОЗМОЖНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ПРОНИКНОВЕНИЯ И «РАЗДЕВАНИЯ»

Предложены два различных "Механизма проникновения и «раздевания» не только вируса гриппа, но и вообще вирусов, имеющих внешнюю оболочку. Обе точки зрения основаны главным образом.на исследованиях в электронном микроокопе. Один из таких механизмов - виронексис, который, .как полагают, является процессом ппноцитоза, когда вирусные частицы включаются в пиносомы, сливающиеся впоследствии с лизосомами, и ферменты лизосом вызывают «раздевание» вируса (Fazekas de St. Grot, 1948). Электронно-микроскопические подтверждения этой точки зрения получены в работах Dales и Choppin (1962), а также Dourmashkin и Tyrrell (1970). Через 10 мин после заражения были видны вирусные частицы, находящиеся в непосредственном контакте с поверхностью клетки, а к 20-й минуте частицы обнаруживали внутри цитоплазматичеоких вакуолей. В противоположность этому исследованию Morgan и Rose (1968) предполагают, что проникновение может являться следствием слияния оболочки вируса с мембраной клетки-хозяина. Таким образом, в настоящее время нет единого мнения относительно механизма проникновения вируса гриппа.

Как описано в гл. 5, вирионы вируса гриппа содержат РНК-полимер"азу, ассоциированную с их рибонуклеопротеи-новыми компонентами. Маловероятно, следовательно, чтобы процесс «раздевания» был пространственно разобщен с процессом освобождения рибонуклеолротеина. А эта стадия происходит на поверхности клетки, согласно механизму слияния мембран, и в фагоцитарных везикулах, согласно механизму виройексиса.

III. ТРАНСКРИПЦИЯ А. ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ СИНТЕЗА РНК

После «раздевания» онРНК вириона должна быть транскрибирована в комплементарную РНК- Вводимая с инфицирующей частицей РНК-полимераза должна функционировать в первой стадии размножения вируса (см. гл. 5). Геном вируса гриппа может быть выделен из вирионов только в виде

отдельных фрагментов (см. гл. 6). Более того, он и функционирует в виде -отдельных фрагментов, как "было показано генетическим анализом (ом. гл. 7) и ступенчатой инактивацией инфекционного вируса (Scholtissek, Rott, 1964). В связи с этим следует предположить, -что полимераза инициирует синтез РНК в каждом индивидуальном фрагменте. Поскольку РНК не существует в клетке в виде свободной молекулы, а всегда одета белком, возникает вопрос: с каким белком связана вирусная РНК в процессе своей репликации?

Опыты, проводимые три изучении синтеза РНК вируса гриппа, представляют большие трудности, поскольку актино-мицин D не может быть использован для выявления продукции вирусной РНК при специфическом подавлении синтеза клеточных РНК, так как этот антибиотик подавляет размножение вируса гриппа (Barry et al., 1962; Rott, Scholtissek, 1964; Barry et al., 1965; Pons, 1967). По этой причине для определения последовательности синтеза РНК во времени применили специфическую гибридизацию пульс-меченной РНК в различные моменты после заражения с избытком либо немеченой вРНК, либо вкРНК с последующей обработкой РНК-азой (Scholtissek, Rott, 1970). В ранних стадиях инфекционного цикла превалировал синтез вкРНК, достигая максимума примерно «о второму часу после заражения, тогда как в поздних стадиях большая часть продуцируемой вирус-специфической РНК являлась вРНК. Krug (1972), используя другой метод, также показал, что через 4 ч после заражения синтез BIKPHK ПОЧТИ ПОЛНОСТЬЮ прекращается. После экстракции фенолом обнаруживается относительно небольшое количество днРНК (Scholtissek, Rott, 1970).

В связи с тем что тот или другой тип вирусной РНК обладает информационным1!! функциями и используется как матрица для синтеза вирусных белков (см. раздел IVA), может иметь место некоторый трансляционный контроль на уровне дифференциального катаболизма вирусной РНК. Поэтому были проведены иульс-чейз-эксперименты для изучения стабильности РНК вируса гриппа in vivo. Установлено, что в противоположность клеточной РНК оба типа вирусной РНК полностью стабильны в течение 90-шшутного периода ченза (Scholtissek et al., 1972).

Ранее при исследовании синтеза вирусной РНК in vivo, когда актиномицин D добавляли в поздних стадиях инфекционного цикла (Duesberg, Robinson, 1967; Nayak, 1970; Ма-hy, 1970), не учитывали, что антибиотик специфически инги-бирует синтез комплементарной РНК in vivo (Scholtissek, Rott, 1970; Pons, 1973). Поскольку днРНК выделяется из зараженных клеток в виде по крайней мере пяти отдельных фрагментов, был сделан вывод, что вирусная РНК также синтезируется в виде фрагментов (Pons, Hirst, 1968).

Б. ЛОКАЛИЗАЦИЯ СИНТЕЗА ВИРУСНОЙ РНК ВНУТРИ КЛЕТКИ-ХОЗЯИНА

Из данных, полученных при радиоавтографии, был сделан вывод, что местом синтеза вирусной РНК являются, по-видимому, ядра клеток (Scholtissek et al., 1962; Barry et al., 1974). Поскольку периоды пульса, применявшиеся в этих исследованиях, -были все еще слишком большими, нельзя исключить, что вирусная РНК синтезируется в цитоплазме клетки и после этого транспортируется в ядра, где она может накапливаться. Кроме того,вРНК и вкРНК могут синтезироваться в клетке в различных местах.

В. ИНГИБИРОВАНИЕ СИНТЕЗА ВИРУСНОЙ РНК 1. Актимомицин D, митрамицин и а-аманитин

При добавлении актиномицина D или митрамицина, которые препятствуют матричной функции ДНК, к зараженным клеткам в момент, когда там уже присутствует вирусная РНК-зависимая РНК-иолимераза (например, через 2 ч после инфекции), вРНК продолжает синтезироваться в течение еще примерно 2 ч. Продукция вкРНК, однако, немедленно прекращается. Позже синтез вРНК также падает, указывая на то, что для него необходимо непрерывное образование вкРНК (Rott et al., 1965; Scholtissek, Rott, 1970; Scholtissek et al., 1970; Pons, 1973). Gregoriades (1970) показала, что актино-мицин D оказывает также сильное влияние на синтез вРНК при добавлении в поздних стадиях инфекционного цикла. В этих опытах синтез вирусной РНК определяли по увеличению включения меченого уридина в тотальную РНК зараженных клеток. Такое увеличение может быть устранено добавлением актиномицина D. Однако следует иметь в виду, что заражение вирусом гриппа вызывает увеличение включения меченого уридина в клетку после инфекции (Scholtissek et al., 1967) и что актиномицин D оказывает ингибирующее влияние на это включение (Scholtissek et al., 1969). сиАмани-тин, который не имеет сродства к ДНК, &о влияет на активность одной из клеточных РНК-полимераз (РНК-подимера-за II), также ингибирует синтез вкРНК при добавлении в культуральную жидкость сразу же после заражения (Rott, Scholtissek, 1970; Mahy et al., 1972).

Механизм "Специфического ингибирования этими антибиотиками синтеза вкРНК не совсем понятен, так как они не оказывают влияния на образование вкРНК in vitro. Таким образом, эти антибиотики действуют только in vivo, хотя фермент, синтезирующий вкРНК, может быть выделен из клеток, к которым через 2 ч после инфекции был добавлен актиномицин D (Scholtissek, Rott, 1969a).

Размножение "вирусов гриппа может "быть подавлено также другими воздействиями на ДНК клетки-хозяина - введением митомнцина С, предобработкой ультрафиолетовым облучением или удалением ядер клетки перед инфекцией (Barry, 1964; Rott et al., 1965; Nayak, Rasmussen, 1966; Fol-.lett et al., 1974; Kelly et al., 1974). Механизм, с помощью которого эти воздействия влияют на размножение.вируса гриппа, может "быть одинаковым с механизмом действия других антибиотиков. Единственное предположение, "которое можно сделать на основании этих исследований, это то, что имеется необходимость в "функционально "активных ядрах клетки и (или) в ДНК-зависимой функции клетки для размножения вирусов гриппа. Что ■это за функции-сказать нельзя.

2. Циклогексимид

При добавлении циклогексимида, специфически подавляющего синтез белков в клетках животных, через 2 ч после заражения вирусом гриппа образование вРНК немедленно прекращается, тогда 1как образование вжРНК все еще продолжается по крайней мере в течение 2 ч (Scholtissek, Rott, 1970; Pons, 1973). Пока неизвестно, необходим ли непрерывный синтез вирусного "или "Клеточного "белка, используемого в "Качестве /кофактора для полимеразы, синтезирующей вРНК, или необходим некоторый "белок (например, NP-белок) для стабилизации вновь синтезированной вРНК, или подавление синтеза определенного вирусного "белка приводит к непрерывному образованию вкРНК, синтез которой в норме выключается через 3 ч после заражения. Это выключение может ■быть необходимо для запуска синтеза вРНК- Исследования с темпер атурочуветвительными мутантами должны ответить на некоторые из этих вопросов.

Опыты Bean и Simpson (1973) показали, что первичная транскрипция in vivo (синтез вкРНК на матрице ъРНК с помощью полимеразы инфицирующей частицы) не подавляется циклогексимидом, тогда ка,к актиномицин D подавляет транскрипцию полностью. Таким образом, циклогексимид не воздействует in vivo на активность полимеразы, вводимую с инфицирующей частицей и синтезирующую вкРНК- Он, однако, подавляет синтез новой полимеразы, необходимой для производства вкРНК.

3. Глюкозамин

Глюкозамин, как известно, истощает пул УТФ в клетках куриного эмбриона путем образования УТФ-]М-ацетилглкжо-замина (Scholtissek, 1971). Когда раствор Эрла, содержащий глюкозу, используется в качестве жультуральной среды, он

оказывает влияние только на синтез вирусных глнкопротеи-нов (см. раздел V). Если, однако, глюкозу как источник энергии заменить лируватом или фукозой, то истощение пула УТФ этими аминосахарами происходит примерно в 10 раз активнее. При этих условиях пул УТФ клетки-хозяина становится специфическим ограничителем акорости синтеза вРНК, тогда как синтез (клеточной РНК еще не затрагивается (Scholtissek, 1975). В результате подавления синтеза вирусной РНК отсутствует и образование вирусных белков.

Эти данные могут быть интерпретированы двояко: или вирусная РНК-зависимая РНК-полимераза имеет низкое сродство к УТФ по сравнению с клеточными ДНК-зависимым"и РИК-полимеразами, или в клетке существуют два более или менее независимых пула УТФ, один из которых может "быть использован для синтеза вирусной РНК и испытывает большее воздействие со стороны глюкозамина, чем другой пул, который может использоваться в качестве субстрата РНК-по-лимеразами «летки.

Г. СИНТЕЗ ВИРУСНОЙ РНК IN VITRO

В клетках, зараженных вирусом гриппа, несколькими исследователями обнаружена РНК-зависимая РНК-полимераза (Но, Walters, 1966; Scholtissek, Rott, 1969a; Skehel, Burke, 1969; Ruck et al., 1969; Mahy, Bromley, 1970; Compans, Cali-guiri, 1973). Большая часть активности фермента обнаружена в микросомальной фракции зараженных клеток. В системе in vitro эта активность снимается РНК-азой, но не ДНК-азой. Это значит, что внутренней матрицей является РНК- Реакция требует присутствия всех четырех нуклеозидтрифосфатов и чувствительна к актином-ицину D. Большая часть продукции реакции in vitro имеет низкую относительную молекулярную массу. Данные Horisberger и Guskey (1973) предполагают, что в цитоплазме присутствуют две различные активности ферментд: одна является М§++-завиеимой и подавляется относительно высокими концентрациями солей, другая - Мп++-зависима и более резистентна к солям. Последняя активность фермента обнаруживается также внутри вирусной частицы (см. гл. 5).

Относительно продукта цитоллазматического фермента в системе in vitro получены противоречивые результаты. Ruck ■и соавт. (1969) сообщили, что в их руках этот фермент синтезирует по крайней мере "некоторые из РНК вирионного типа (от 14 до 19S). Авторы пришли;к такому заключению при определении состава оснований продукта в системе in vitro после инкубации микросомальной фракции со всеми четырьмя -меченными нуклеозидтрифосфатами известной удельной радиоактивности. Однако данные по изучению ближайших

к адениловой кислоте соседей, лолученные в той же работе с использованием,[(а-32Р] АТФ, согласуются с данными анализа ближайших соседей, .полученными Scholtissek (1969), в результате чего был сделан вывод о том, что продукт в системе in vitro обладает структурой вкРНК. Mahy и Bromley (1970) в своей первоначальной публикации также заявили, что некоторая часть продукта в системе in vitro, полученного с помощью цитоплазматического фермента, должна "быть вРНК. Однако недавно Hastie и Mahy (1973) при анализе ближайших соседей и специфической гибридизации подтвердили образование цитоплазматическим ферментом почти исключительно вкРНК, как это было впервые показано Scholtissek (1969). Caliguiri и Compans (1973) также выделяли РНК-по-лимеразу из цитоплазмы клеток, зараженных вирусом гриппа, которая в системе in vitro синтезировала РНК, не менее 90% которой имеет последовательность оснований, комплементарную чвРНК. Hastie и Mahy (1973) «ашли, что значительный процент продукта в системе in vitro, синтезируемого ядерным ферментом в присутствии актиномицина D, не -был способен пибридизоватьея с немеченой вРНК- Пока неясно, какого типа РНК не способна к такой гибридизация. Очень малая часть РНК, синтезируемой при этих условиях, гибри-дизуется с немеченой акРНК (Scholtissek, неопубликованные данные).

Кинетика включения меченого ГТФ в вирусную РНК может быть интерпретирована как свидетельствующая о том, что реинициация синтеза РНК в системе in vitro отсутствует. Если неочищенный препарат фермента инкубируют при низких концентрациях солей, почти вся вновь синтезированная РНК изначально является однонитчатой. Однако после экстракции фенолом "большой процент РНК становится РНК-азорезистентным. Фенол переводит промежуточную реплика-тивную структуру, состоящую из однонитчатой матрицы и вновь синтезированной вкРНК, удерживаемых друг с другом в месте репликации молекулой" полимеразы, в частично дву-нитчатую структуру (Feix et al., 1967; Oberg, Philipson, 1971). Эти данные о продукте фермента вируса гриппа в системе in vitro можно интерпретировать таким образом, что полимераза не только инициирует и продолжает полимеризацию, но она отделяет вновь синтезированную цепь от своей матрицы. В противном случае образуется двунитчатая структура РНК, которая не обладает "биологическими функциями (Paffenholz, Scholtissek, 1973). Если инкубация проводится при высокой концентрации солей или с очищенным ферментом, большой процент продукта уже является двунитчатой РНК до экстракции фенолом (Schwartz, Scholtissek, 1973).

Это свойство РНК-нолимеразы вируса гриппа синтезировать исключительно вкРНК в системе in vitro -было исполь-

Зовано для установления генетического родства различных штаммов вируса гриппа по определению гомологии в последовательности оснований между ними (Scholtissek, Rott, 1969b; Hobson, Scholtissek, 1970; Anschutz et al., 1972).

IV. СИНТЕЗ ВИРУСНЫХ БЕЛКОВ

А. ТРАНСЛЯЦИЯ В СИСТЕМЕ IN VITRO

Проблема РНК какого типа-вир ионного или комплементарного - является "информационной для синтеза вирусных белков, пока не решена. Были получены противоречивые результаты относительно вида вируеспецифической РНК, связанной с полисомами. Nayak (1970) обнаружил в поли-сомной области сахарозного градиента, главным образом вРНК, в то время как Pons (1972) выделил из полисам исключительно вкРНК. Последнее было подтверждено наблюдением, что после добавления через 2 ч после заражения актиномицина D, который предпочтительно воздействует на синтез вкРНК (см. раздел III, В, 1), в полисомах зараженных клеток вкРНК не обнаруживается (Pons, 1973).

Используя "белоксинтезирующую систему из Е. coli и вРНК вируса гриппа как матрицу, Siegert и соавт. (1973) обнаружили образование вирусного NP-белка в условиях in vitro. Этот меченый NP-белок -был охарактеризован методом преципитации в геле по тесту Ouchterlony. В противоположность этому Kingsbury:и Webster (1973) не наблюдали никакого вирусного белкового синтеза с вРНК, использовав бе-локсинтезирующую систему, полученную из ретикулоцитов кролика. В этой же системе, однако, они выявили синтез вирусного М-белка (ом. гл. 2) на матрице РНК, изолированной из зараженных клеток. Таким образом, в настоящий момент нельзя ответить на вопрос, только ли вириопная или только комплементарная, или некоторые фрагменты РНК одного типа и некоторые фрагменты РНК другого типа используются как матрицы для синтеза белков. Следовательно, пока к вирусам гриппа трудно применять определение «отрицательная» или «положительная» вирусная цепь, как это предложено Baltimore (1971).

Б. СИНТЕЗ ВИРУСНЫХ БЕЛКОВ IN VIVO

Изучению синтеза вирусных "белков "благоприятствует то, что в зараженной клетке синтез полипептидов клетки замещается вирусспецифическим синтезом. В клетках фибробла-стов Куриного эмбриона, зараженных ВЧП (Joss et al., 1969; Skehel, 1972; Klenk, Rott, 1973), и в клетках BHK 2IF зараженных ■ штаммом WSN вируса гриппа (Lasarowitz et al., 1971), к 4-му часу после инфекции синтезируются почти

только одни вирусные белки (31). Несколько ранее исследователи в зараженных клешах наблюдали синтез трех или четырех полипептидов (Taylor et al., 1969; Joss et al.,. 1969; Holland, Kiehn, 1970; White et al., 1970). Впоследствии были обнаружены и другие полипептиды (Lazorowitz et al.,. 1971; Skehel, 1972; Klenk et al., 1972b; Krug, Etkind, 1973). В целом в зараженных клетках были обнаружены все структурные -белки: один или два Р-белка, субъединица нуклеокап-оида NP, мембранный белок М, гемагтлютинияовый глико-протеин в нерасщепленной (НА) и расщепленной (НА1 и НА2) формах и субъединица NA.

Кроме вирионных "белков, были описаны один или два неструктурных белка (NS).

Имеются заметные различия <в уровнях синтеза отдельных вирусных полипептидов. NP- и NS-полипептиды обычно первыми обнаруживаются в зараженных «летках. Skehel (1973) предположил, что полипептиды Р2, NP и NS, которые первыми обнаруживаются в «клетках, зараженных ВЧП, являются

продуктами фрагментов РНК, образуемых при селективной транскрипции вирионной полимеразой трех фрагментов вирусного генома. Когда «летки заражали в присутствии цик-.логексимида и пульсовую метку добавляли после удаления антибиотика, обнаруживались только три эти полипептида. На основании этого предположили, что молекулы РНК для этих.компонентов образовались с помощью вводимой вирионной лолимеразы в процессе первичной транскрипции. С 4-го по 6-й час после заражения куриных фибробластов ВЧП увеличивается уровень синтеза М-белка, а синтез NS-лолилепти-да уменьшается (Skehel, 1972, 1973). Таким образом, уровни синтеза иолипептидов могут индивидуально контролироваться и могут варьировать в течение цикла роста.

Кроме расщепления.полипептида НА на НА1 и НА2, нет данных о том, что вирусспецифические полипептиды вируса гриппа получаются в результате расщепления крупных предшественников (Taylor et al., 1969; Lazarowitz et al., 1971, Skehel, 1972; Klenk, Rott, 1973).

Недавно была получена новая информация о локализации вирусных компонентов в зараженных клетках при использовании авторадиографии (Becht, 1971) или методов фракционирования клетки и электрофореза в геле (Taylor et al., 1969, 1970). Согласно этим исследованиям, синтезы всех вирусных ■белков осуществляются, по-видимому, в цитоплазме. Предыдущие исследования локализации нуклеолротеинового антигена методом иммунофлюоресценции интерпретировали как указывающие на то, что синтез осуществляется в ядре с последующим выходом антигена в цитоплазму (Liu, 1955; Brei-tenfeld, Schafer, 1957; Holtermann et al., 1960). Однако ясно, что иммунофлюоресценция определяет накопление антигена, .а не его синтез (см. раздел IV, Б, 2).

1. РНК-полимераза

Вирус-специфическая активность РНК-зависимой РНК-по-лимеразы может быть обнаружена в клетках, зараженных вирусом гриппа, между 13Д и 3 ч после инфекции в зависимости от использованной системы клеток (Scholtissek, Rott, 1969а; Skehel, Burke, 1969; Ruck et al., 1969; Mahy, Bromley, 1970). Это первая выявляемая вирусспецифичеокая активность после заражения. Большая часть вирусной активности лолимеразы выявляется в микросомальной фракции; некоторая же часть этой активности остается в ядрах и не может ■быть удалена оттуда даже интенсивным их промыванием. Фундаментальные отличия в кинетике проявления или в необходимых кофакторах между ядерным и микросомальным ферментами отсутствуют (Scholtissek, Rott, 1969a; Mahy et al., 1975).

При дальнейшем фракционировании цитоплазмы в ступенчатом сахарозном градиенте то методу Caliguiri и Tamm (1970) активность полимеразы обнаруживается в шероховатых мембранах (Compans, Caliguiri, 1973; Klenk et al., 1974a).

Поскольку активность вирусной полимеразы была обнаружена в очищенных вирусных частицах (см. гл. 5), возникает вопрос, с каким из вирусных "белков она может быть ассоциирована. Полимераза, "выделенная из клеток, зараженных вирусом гриппа, была очищена примерно в 200 раз. Единственным вирусспецифическим продуктом, ассоциированным с активностью полимеразы, был РНП-антиген (белок NP плюс вирусная вРНК, определенные то методу связывания комплемента). Все попытки удалить РНК из этого комплекса приводили к полной потере активности фермента (Schwarz, Scholtissek, 1973). Кандидатом на роль вирусной полимеразы был выдвинут Р-белок (Kilbourne et al., 1972). Когда ферментативный "комплекс, меченный in vivo аминокислотами, выделяли из клеток, зараженных вирусом гриппа, и очищали примерно в 35 раз, электрофоретический анализ выявил сначала в этом комплексе только ЫР-белоа< (Compans, Caliguiri, 1973). Впоследствии, однако, при других условиях введения;метки удалось обнаружить и Р-белок (Caliguiri, Compans, 1974). С другой стороны, Klenk и соавт. (1974) обнаружили Р-белок в цитоплазматическом золе, "который не обладает полимеразной активностью (Scholtissek, Rott, 1969a; Skehel, Burke, 1969). Эти наблюдения могут означать, что Р-белок осуществляет свою (Предполагаемую активность ферментов только при связывании с РНП-антигеном.

То, что сам по себе РНП-антиген обладает полимеразной активностью, маловероятно, поскольку гипериммунная сыворотка против РНП-антигена не ингибнрует активности полимеразы, тогда как конвалесцентная сыворотка, которая может содержать антитела к полимер азе, ингибирует ее (Scholtissek et al., 1971). Такая конвалесцентная сыворотка (которая была получена из животных, перенесших инфекцию вирусам гриппа А) инги"бировала активность полимеразы всех изученных штаммов вируса гриппа А, но не подавляла активность полимеразы вируса гриппа В. Все эти наблюдения согласуются, с идеей о том, что РНП-антиген (BPHK + NP = = белок), может служить матрицей для синтеза вкРНК-

2. Белок нуклеокапсида

NP-белок связывается с "вирусной РНК, образуя РНП-антиген. Это верно для NP-белка, выделенного не только из вириона, но.и из зараженной клетки (Schafer, 1957). "Серологическими средствами он может быть впервые выявлен, при-

мерно через 3 ч после заражения, за час до появления гемаг-глютинина (Breitenfeld, Schafer, 1957). По прошествии этого времени титр РНП-антигена существенно не увеличивается. Это может происходить вследствие равновесия между новым синтезом и включением в зрелые частицы. По метке NP-белок может "быть обнаружен в зараженных клетках в течение 2-го часа после инфекции (Scholtissek, Rott, 1961; Krug, 1972).

С помощью флюоресцирующих антител РНП-антиген сначала обнаруживается в ядрах. Позже он появляется и в цитоплазме (Breitenfeld, Schafer, 1957). При определенных условиях, таких, как абортивная инфекция (Franklin, Brieten-feld, 1959), в присутствии р-флюорофенилаланина (Zimmer-mann, Schafer, 1960), или в условиях феномена фон-Магнуса (Rott, Scholtissek, 1963), РНП-антиген остается в ядрах.

Раннее накопление РНП-антигена в ядрах зараженных клеток не означает, что NP-белок также синтезируется внутри ядер. Авторадиографические исследования, а также применение методов фракционирования клетки указывают на ц"итоплазматический синтез этого и другого, богатого аргинином, белка и на быстрый транспорт их из цитоплазмы в ядра (Taylor et al., 1969, 1970; Becht, 1971).

В экстрактах зараженных клеток определенная фракция РНП-антигена содержит вкРНК (Pons, 1971; Krug, 1972; Krug, Etkind, 1973), хотя в вирусных частицах находят только один тип РНК (что следует из отсутствия какой-либо самогибридизации вРНК) (Scholtissek, Rott, 1971; Pons, 1971). Невозможно решить, имеет ли РНП-антиген, содержащий вкРНК, специфическое значение в процессе размножения вирусов или он является лишь артефактом, появляющимся в процессе клеточного фракционирования. Было показано, что обе цепи РНК одинаково хорошо связываются с NP-белком in vitro (Scholtissek, Becht, 1971). Таким образом, если имеется сколько-нибудь свободного NP-белка и свободной вкРНК, в процессе гомогенизации незамедлительно образуется соответствующий РНП-антиген. Вирионная РНК.может быть вытеснена из РНП-антигена поливин"ИлсульфатО"М (Pons et al., 1969). Следовательно, можно проверить, осуществимо ли замещение различных вирусных РНК в РНП-антигене в клеточных гомагенатах. Из изменений состава оснований вирусной РНК, меченной в течение различных промежутков времени 32Р и выделенной из цитоплазматического РНП-антигена, Krug (1972) заключает, что некоторая часть вкРНК, прежде чем она включится в РНП-антиген, существует в виде, свободном от NP-белка. Включение 32Р в РНК жлеток животных происходит со значительной лаг-фазой из-за довольно медленного включения меченого,фосфора "в "(х-положение нуклео-зидтрифосфатов (Scholtissek, 1965). До тех пор, пока соответствующие корректировки для расчетов изменений состава

оснований не сделаны, данные Krug (1972) следует интерпретировать с осторожностью.

Кинетический анализ «появления РНП-антигена в ядрах и цитоплазме, проведенный Krug (1972), -предполагает, что РНП-антиген, накапливающийся в ядрах, не является предшественником РНП-антигена, найденного в цитоплазме.

3. Неструктурные белки

Для зараженных клеток было описано несколько неструктурных вирусспецифических белков -неизвестной функции. Один из них с относительной молекулярной массой 25 000, накапливающийся в "больших количествах, был обозначен как NS (Lazarowitz et al., 1971). В полиакриламидных гелях он имеет скорость миграции, близкую к подвижности М-бел-ка. Однако оба белка, по-видимому, не зависят друг от друга, как видно из различий в их пептидных картах. Большие "количества NS-"белка обнаружены в ядрах (Lazarowitz et al.,. 1971; Krug, Etkind, 1973). Эти сведения согласуются с данными предыдущих иммунофлюоресцентных исследований Dim-mock (1969), который наблюдал "яркое окрашивание ядер с антисыворопкой, специфичной ж неструктурным вирусным антигенам, и это окрашивание, вероятно, отражало наличие NS-"белка. Как "было установлено, этот белок также является основным вирусспецифическим белком во фракциях свободных и связанных с мембранами рибосом, выделяемых из зараженных клеток (Pons, 1972; Compans, 1973; Klenk et al.,. 1974a). Ассоциация NS с рибосомами, по-видимому, зависит от тонной силы (Krug, Etkind, 1973). В буферах с низкой ионной силой ЭТОТ нолипаптид -адсорбировался на обеих ри-босомальных субъединицах, тогда как при добавлении соли удалялся от них.

Недавнее исследование (Gregoriades, 1973) выдвинуло некоторые сомнения в идентификации NS как неструктурного" полипептида, отличного от вирионного полипептида М. Оказалось возможным экстрагировать М-полип-ептид из вирионо© кислым хлороформметанолом, и белок с идентичной электрофор етвческой подвижностью может -быть также экстрагирован из целых зараженных клеток, -ядер или полисом. Анализ-продуктов триптическои обработки М-"белка, а также ядерного и ассоциированного с рибосомами -белков, привел к множеству совпадений, предполагающих, что М- и NS-белкй "идентичны. Необходима, однако, дальнейшая информация для убедительного объяснения этих результатов.

В дополнение к NS могут существовать другие неструктурные вирусспецифические комлоненты, хотя ни один из них. не был достаточно охарактеризован. Используя антисыворотку, направленную против неструктурных вирусных антигенов,

Dimmock и Watson (1969) преципитировали радиоактивно меченные полипептиды из зараженных клеток. Электрофоре-тический анализ в полиакриламидном геле позволил предположить наличие нескольких неструктурных полипептидов с основным компонентом, соответствующим NS. Один из остающихся неструктурных компонентов мигрирует более быстро и может соответствовать компоненту с относительной молекулярной массой от 10 000 до 15 000, описанному Skehel (1972), Krug и Etkind (1973).

4. Мембранный М-белок

М-белок, который "выстилает внутреннюю поверхность двойного липидного слоя оболочки и которым богат вирион, находят в зараженных клетках в относительно небольших количествах. Это предполагает не только контролируемость синтеза М-белма, но и возможность того, что этот синтез является лимитирующей стадией репродукции вируса (Lazarowitz et al., 1971). Эту концепцию поддерживают данные о том, что при температуре 29 °С, при которой образование вируса подавлено, М-белок является единственным (вирусопе-дифическим белком, который нельзя обнаружить в зараженных клетмах (Klenk, Rott, 1973).

М-белок {можно обнаружить на гладких и плазматических мембранах зараженных клеток (Lazarowitz et al., 1971; Corn-pans, 1973a; Klenk et al., 1974a). Эти данные свидетельствуют о сродстве этого белка к мембранам.

5. Гемагглютинин

Гемагглютинин синтезируется как большой гликопроте-ин - предшественник НА, который впоследствии расщепляется на два меньших гликопротеина: HAi и НА2 "(Lazarowitz «t al., 1971). Расщепление, которое можно подавить ингибиторами протеаз (Klenk, Rott, 1973), осуществляется, по-видимому, протеолитическими ферментами клетки-хозяина (Lazarowitz et al., 1973). Степень расщепления зависит от штамма вируса, клетки-хозяина, уровня цитоиатического эффекта и присутствия или отсутствия в среде сыворотки (Lazarowitz et al., 1971, 1973а, b; Klenk, Rott, 1973; Stanley et al., 1973). Так, ВЧП, выращенный в культуре фибробластов куриного эмбриона, содержит только расщепленные глишпротеины ге-магглютннина, тогда как такое расщепление фактически отсутствует, если выращивать вирионы WSN в клетках MDBK в отсутствие сыворотки. В присутствии сыворотки, однако, гемагглютинин WSN также расщепляется. Расщепление в этой

системе имеет место на.плазматической мембране (Lazaro-witz et al., 1973a). В системе ВЧПмеханизм такого расщепления, по-видимому, другой. Расщепление «происходит.на внутриклеточных мембранах, и плазминоген в этом случае не является необходимым (Щепк et al., 1974a). Степень расщепления резко уменьшается три 25 °С (Klenk, Rott, 1973).

Расщепление НА не является необходимым условием для гемагглютинирующей активности и для сборки вириона (La-zarowitz et al., 1973a; Stanley et al., 1973), но исследования, проведенные недавно, "обнаружили, что оно необходимо для инфекционности (Klenk et al., 1975b). Эти данные согласуются с гипотезой о том, что, помимо своей роли в адсорбции, НА* имеет и другую функцию в инфекционном процессе и что расщепление необходимо для этой функции. На основании того, что расщепление НА является феноменом, зависящим от «летки-хозяина, и что частицы, содержащие нерасщеплен-ный НА, обладают низкой инфакционностью, предполагают зависимость диапазона хозяев и распространения инфекции вируса гриппа от присутствия протеазы клетки-хозяина как. активирующего фермента.

В опытах по фракционированию «леток, зараженных ви

русом гриппа, обнаружено, что гликопротеины НА всегда ас

социированы с мембранами (Compans, 1973a; Klenk et al.,.

1974а). Внутриклеточная локализация этих белков ж их миг

рация от шероховатых мембран к гладким эндоллазматиче-

ского ретикулума и к плазматическим мембранам будут де

тально описаны в разделе VII, В. . .,

6. Нейраминидаза

Вирусная NA* как активный фермент была обнаружена,

через 3 ч после инфекции в хорион-аллантоиеных мембра

нах, и путем экстраполяции установлено, что начало ее син

теза приходится на 1-2-е часы после заражения (Noll et al.,

1961). Внутриклеточную локализацию NA* исследовали пу

тем фракционирования клеток, и нашли, что она, по-видимо

му, подобна локализации НА* (Compans, 1973a; Klenk et al.,

1974а). NA* была обнаружена в ассоциации с мембранами,

полученными из гладкого эндоплазматичеекого ретикулума,

при определении ее по биологической активности и по анали

зу в полйажриламидном геле. Активность фермента была най

дена также во фракциях, содержащих шероховатые мембра

ны. Эти данные согласуются с данными, полученными при

иммунофлюорееценции (Maeno, Kilbourne, 1970). Через 4 ч

после заражения яейраминидазу можно обнаружить в цито

плазме; позже она, по-видимому, концентрируется на пери

ферия клетки.

V. СИНТЕЗ УГЛЕВОДОВ

Углеводы участвуют в образовании гликопротеинов и гли-колилидов оболочки вируса гриппа (Klenk et al., 1972a). Гли-колипиды миксовирусов (происходят из плазматических мембран клетки-хозяина (Klenk, Choppin, 1970), «о не было определено, что преимущественно (включается в вирион: уже существовавшие или вновь синтезированные гликолипиды.

Использование радиоактивных предшественников, таких, как глюкозамин, манноза, галактоза и фукоза, которые специфически включаются в вирусные глмкопелтиды, показало, что углеводные боковые цепи этих гликопептидов вновь синтезируются в процессе инфекции (Haslam et al., 1970; Corn-pans et al., 1970a; Schwarz, Klenk, 1974). Опыты по фракционированию (клеток дали дополнительную информацию о местах гликозилирования вирусных гликопротеинав. Глюкозамин ассоциирован с НА-полипептидом во фракциях как гладких, так и шероховатых цитоплаэматических мембран; однако фукоза ассоциирована с НА в гладких, но не в шероховатых мембранах (Compans, 1973b). .Подавление белкового синтеза пуромицином почти незамедлительно останавливает включение глюкозамина, в то время как фукоза еще продолжает включаться в течение примерно 10-15 мин (Stanley et al., 1973). Наконец у FPV гликопротеид - предшественник НА и продукты расщепления HAj <и НА2 содержат, по-видимому, полный состав маннозы « глюкозамина, тогда как содержание фукозы и галактозы значительно выше в продуктах расщепления (Klenk et al., 1975a; Schwarz, Klenk, 1974). Эта наблюдения предполагают, что биосинтез углеводных боковых целей гликопротеинов НА осуществляется по стадиям с различными остатками Сахаров, добавляемыми в разных участках клетки. Глюкозамин и манноза (присоединяются, по-видимому, к полипептидам НА на шероховатых мембранах вскоре после или даже в процессе синтеза поляпептида, в то время как фукоза, вероятно, прикрепляется позже с помощью трансфераз, присутствующих в гладких мембранах.

Эти гликозилтрансферазы являются, вероятно, ферментами клетки. Следовательно, углеводная (часть гликопротеидов определяется, по-видимому, клежой-хозяином. Имеются, однако, свидетельства того, что в дополнение к этим ферментам клетки-хозяина существенную роль в образовании углеводных боковых цепей играет вирусная NA*. Установлено, что поверхность оболочек микеовирусов лишена нейраминовой кислоты (Klenk, Choppin, 1970b; Klenk et al., 1970), в то время как в вирусных оболочках, которые не содержат этого фермента, такой углевод является обычной составной частью (Klenk, Choppin, 1971; McSharry, Wagner, 1971; Renkonen et al., 1971). Эти данные позволяют предположить, что отеут-

ствие нейраминовой кислоты является существенной особенностью миксовирусов. Недавно удалось показать, что NA* ответственна за удаление нейраминовой кислоты из оболочки вируса гриппа, предотвращая тем самым образование на вирусной оболочке (рецепторов, которые в противном случае приводили оы к образованию больших агрегатов вирусных частиц (Palese et al., 1974). Эти данные поддерживают концепцию, что углеводная часть НА* как основного поверхностного гликопротеина является продуктом комбинированного действия (Клеточных транефераз и вирусной NA*. Благодаря ее действию вирус способен вводить вирус-специфическую модификацию в (Первоначально специфичную для хозяина, сложную структуру углевода-модификацию, которая, по-видимому, существенна для -биологической активности вируса.

D-глюкозамин и 2-дезокси-0-глк>коза ингибируют образование биологически активного НА*, NA* и инфекционного вируса (Kilbourne, 1959; Kaluza et al., 1972). Биохимические исследования выявили, что эти сахара.конкурируют с биосинтезом вирусных гликоггротеинов (Ghandi et al., 1972; Klenk et al., 1972b). В присутствии этих ингибиторов размер глигко-пр"отеидов НА уменьшается. Степень уменьшения зависит от дозы. Так, при увеличении концентр!ации сахара гликопроте-пд НА с относительной молекулярной массой 76 000 постепенно превращается в соединение с молекулярной массой 64 000, которое было обозначено как HA0 (Klenk et al., 1972b; Schwarz, Klenk, 1974). Сдвиг молекулярной массы параллелен уменьшению содержания углеводов и, как -было установлено, белок HA0 почти свободен от углеводов (Schwarz, Klenk, 1974). Эти результаты показывают, что HA0 является не полностью гликозилированной или «егликозилированной полипептидной цепью гликопротеина НА и что «нгибирующее действие D--глюкоз амин а и 2-дезокси-0-глюкозы осуществляется благодаря повреждению гликозилирован-ия. Полипептид HA0 ассоциирован -с мембранами, как -и нормальный НА. Он также мигрирует от шероховатого к гладкому эядопла-з-■матичеокому ретикулуму, где расщепляется на полипептиды НА01 и НА02. Следовательно, углеводы, -вероятно, несущественны для сродства этого полипептида к мембране. Однако отсутствие гемагглютинирующей активности в зараженных клетках предполагает, что негликоз-илированный белок не способен связываться с рецепторами.

VI. СИНТЕЗ ЛИПИДОВ

Как и все вирусы, обладающие оболочкой, вирус гриппа приобретает свои липиды путем утилизации липидов клетки-хозяина. Это положение подтверждается следующими наблю-

дениями. Липидный состав вируса гриппа, как было установлено, -аналогичен таковому клетки-хозяина (Ambruster, Beiss, 1958; Frommhagen et al., 1959). Липиды клетки-хозяина, радиоактивно меченные -перед заражением, включаются в вирусные частицы (Wecker, 1957). При выращивании вируса в различных клетках-хозяевах выявляются модификации вирусных липидов (Kates et al., 1961, 1962). Вообще липиды вирусов, (которые ■отпочковываются от клеточной поверхности, близко отр!ажают липидный состав плазматической мембраны клетки-хозяина (Klenk, Choppin, 1969; 1970а, b; Renko-nen et al., 1971). Уровень синтеза de novo ф-осфолилидов в клетках фибро-бластов куриного эмбриона оставался неизменным в течение 7 ч после заражения вирусом гриппа; после этого весь синтез липидов был подавлен (Blough et al., 1973). Это подавление, вероятно, не является первичным эффектом, а может быть вторичным по отношению к инги-биро-ванию синтеза РНК или белка или к ".другим цнтолэтическим эффектам.

Таким образом, на основании результатов, полученных к настоящему времени, можно предположить, что синтез вирусных липидов осуществляется посредством нормальных клеточных процессов биосинтеза липидов, а вирусная оболочка формируется путем включения липидов из плазматической мембраны клетки-хозяина.

VII. СБОРКА (см. также гл. 2)

А. ОБРАЗОВАНИЕ НУКЛЕОКАПСИДА

Как уже говорилось, наиболее вероятно, что белок нук-леокапсида синтезируется в цитоплазме. По-видимому, он присутствует там в течение короткого времени в свободной форме, а затем ассоциирует с вирусной РНК, образуя нук-леокапсиды (Klenk et al., 1974; Compans, Caliguiri, 1973). Поскольку NP-белок -быстро включается в яуклеокапсиды, РНК может отбираться из ^реформированного пула (Krug, 1972). Вследствие малых размеров нуклеокапсидов вируса гриппа они не могут быть точно идентифицированы в зараженных клетках с помощью электронной микроскопии. Скопления нитей или волокон диаметром около 5 нм, наблюдаемые в цитоплазме, возможно, представляют вирусные рибо-нуклеопротеины (Apostolov et al., 1970; Compans et al., 1970b).

Имеющиеся данные указывают на то, что РНК-геном вирионов вируса гриппа состоит из 5-7 фрагментов (см. гл. 6).

Следовательно, любая инфекционная частица нуждается хотя бы в одной копии каждого фрагмента. Hirst (1962) пред-

положил, что нуклеокапсиды из внутриклеточного пула могут включаться в (вирионы случайно. Доля "инфекционных вирио-нов Е популяции может быть увеличена путем включения дополнительных фрагментов РНК в средний вирной (Compans et al., 1970). Например, если для инфекционное™ необходимы пять различных фрагментов РНК, во каждый вирной содержит в целом 7 фрагментов, включенных в вирной случай.ю, то приблизительно 22% вир-ионов должны быть инфекционными. Свидетельства в пользу случайного включения фрагментов РНК были подкреплены недавними наблюдениями Hirst (1973) о том, что в вирусной популяции осуществляется рекомбинация между частицами, не образующими бляшек. Способность таких частиц участвовать в рекомбинации можно объяснить отсутствием одного или более фрагментов в частицах при варьировании отсутствующих фрагментов от одной частицы к другой; таким образом, подходящие нары дефектного вируса могут образовывать рекомбинанты.

Б. ПРОЦЕСС ОТПОЧКОВЫВАНИЯ ВИРУСА

Как и большинство вирусов, имеющих оболочку, вирус гриппа собирается на преформированных мембранах клеток; сборка осуществляется путем отпочковывания от плазматической мембраны. Первая демонстрация освобождения вируса от «летки с помощью процесса, не включающего лизис, "была представлена Murphy и Bang (1952) в ранних электронно-микроскопических исследованиях клеток, зар;аженных вирусом гриппа. Были видны выступающие от "поверхности клетки во внеклеточное пространство нитевидные и ■ шарообразные структуры. Вирусных частиц внутри клеток во время образования "инфекционного вируса не было видно и. из этого, следовательно, явствовало, что вирусные частицы формировались на поверхности клетки. Используя меченные ферритином антитела, Morgan и со авт. (1961) наблюдали, что поверхность (клетки содержит вирусный антиген в тех областях, где формируется вирус. Более поздние электронно-микроскопические исследов;ания показали, что поверхность отпочковывающегося вируса содержит такую же, как и клетка-хозяин, мембрану со слоем выступов, соответствующих вирусным «шипам» на внешней поверхности. На внутренней поверхности вирусной мембраны имеется отсутствующий на поверхности клетки дополнительный электронно-плотный слой, который, вероятно, состоит из М-иолипептидов (Bachi et al., 1969; Compans, Dimmock, 1969; Apostolov et al., 1970).

Исследования в электронном микроскопе дали основания ■предположить порядок, в котором вирусные компоненты ас-

социируют на мембране клетки (Bachi et al., 1961; Compans, Dimmock, 1969; Compans et al., 1970b).

Первыми появляются белки вирусной оболочки, включаясь в некоторые области мембраны, которые должны иметь нормальную морфологию; однако.наблюдаемая специфическая адсорбция эритроцитов на этих областях мембраны указывает на присутствие здесь.НА-белка. Затем, по-видимому, М-белок (ассоциирует с внутренней поверхностью таких областей мембран, формируя электронно-плотный слой. Далее с мембраной в этих областях специфически связывается рибо-нуклеопротеин и происходит процесс отпочкования путем изгибания и выпячивания сегмента мембраны и окружения ассоциированного рибонуклеопротеина. Данные электрофореза в полиакриламидном геле также поддерживают идею о том, что белки оболочки ассоциируют с плазматической мембраной быстрее, чем РНП (Lazarowitz et al., 1971). Полипептиды клетки-хозяина вытесняются из мембраны, которая является предшественником оболочки вируса, так как подобные полипептиды не обнаруживаются в очищенных вирионах. Как уже упоминалось, остатки нейраминовой кислоты отсутствуют в оболочке отпочковывающихся частиц вируса гриппа, но присутствуют в соседних участках мембраны клетки (Klenk et al., 1970).

Эти данные доказывают резкий переход в химическом составе между оболочкой отпочковывающейся вирусной частицы и соседствующей мембраной клетки.

Однако, с другой стороны, важной особенностью процесса отпочкования является то, что вирусная оболочка непрерывна с плазматической мембраной клетки-хозяина и морфологически подобна ей (Compans, Dimmock, 1969). Как было упомянуто, липиды в этих оболочках имеют очень близкое сходство с липидами мембраны клетки-хозяина. Эти наблюдения предполагают, что липиды в неизмененной плазматической "Мембране легко обмениваются с липидами в отпочковывающихся вирусных частицах путем радиальной диффузии.

Следовательно, оболочка отпочковывающегося вириона образуется из небольшого участка мембраны клетки, модифицированного включением белков оболочки вириона. Эта концепция, конечно, не заключает в себе необходимость синтеза " всех компонентов оболочки на плазматической мембране.

Действительно, в течение длительного времени было известно, что составные части оболочки должны мигрировать на значительные расстояния из одного участка клетки в другие, чтобы добраться от места своего биосинтеза:к месту сборки оболочки. Breitenield и Schafer (1957) показали, что в клетках, зараженных вирусом гриппа, НА* сначала можно уви-

деть во всех частях.клетки и что он ш повышенной -концентрации локализован в околоядерной зоне. Позднее НА* накапливается в "периферической области «летки, а также может быть продемонстрирован в тонких нитях, которые выступают из мембраны клеши.

Представление о том, что компоненты оболочки мигрируют изнутри «летки,к поверхности, недавно было подтверждено и расширено серией работ с использованием фракционирования клеток и анализа вирусных белков в различных фракциях клеток. Эти работы также дают основание предполагать, что гликопротеин НА, а возможно, и другие белки оболочки синтезируются на шероховатом эндоплазматиче-оком ретикулуме (Compans, 1973a; Klenk et al., 1974). Как выявляется в пульс-чейз-экспериментах, через несколько минут НА обнаруживается уже в мембранах гладкого эндо-плазматического ретикулума (Compans, 1973a; Stanley et al.,. 1973; Klenk et al., 1974) и в плазматической мембране (Stanley et al., 1973). Хотя опыты по чейзу из гладкого эндоплаз-матического ретикулума в плазматическую мембрану и не были проведены, кажется правдоподобным, что НА мигрирует из шероховатого эндаплазматического ретикулума ас плазматической мембране, минуя гладкий эндошгазматиче-ский ретикулум. Следует отметить, что в течение всего времени такой миграции НА и другие белки оболочки являются составными частями мембран, вдоль которых они движутся; ОБИ никогда не обнаруживаются в виде растворенных белков.

Во фракциях гладких мембран, которые, как полагают, происходят главным образом из эндоплазматнческого ретикулума, находят все основные белки оболочки (Compans 1973a; Klenk et al., 1974). Однако их относительные.количества здесь отличаются от таковых в плазматической мембране и вир ионе (Stanley et al., 1973; Klenk et al., 1974). Соотношения М-белка к лликопротещдам НА более высокое в оболочке зрелого вириона, чем в мембранах эндоллазматичеокого ретикулума. Эти данные позволяют предположить, что лишь небольшое количество мембран, несущих гликопротеин НА, превращается в вирусную оболочку, а именно фракции мембран, в состав которых входят л белки, свободные от углеводов. Как уже указывалось, синтез М-белка может быть той стадией, которая лимитирует процесс сборки.вируса.

Различие скорости синтеза разных белков оболочки поддерживает "гипотезу о том, что сборка оболочки-процесс многостадийный. С этой концепцией согласуется вопрос о процессе образования НА*, включающем последовательное присоединение углеводной части и протеолитическое расщепление в ходе миграции первичного генного "продукта.

VIII. ОСВОБОЖДЕНИЕ ВИРУСА ГРИППА

Проблема освобождения вируса гриппа из клетки-хозяина,

по-видимому, тесно связана с проблемой функции вирусной

NA*, о которой уже детально говорилось ранее (см. раз

дел V и гл. 4). То, что этот фермент играет существенную

роль в освобождении вируса, вытекало из способности анти

тел, специфичных к NA*, подавлять такое освобождение (Se-

to, Rott, 1966; Webster et al., Г968). К тому же такие антитела

предотвращают элюцию вируса с эритроцитов (Brown, Laver,

1968). Бактериальная NA*, которая не ингибируется антите

лами к вирусной NA*, способна освобождать вирус от клеток,

обработанных такими антителами (Compans et al., 1969;

Webster, 1970). С другой стороны, двухвалентные антитела

к NA также вызывают агрегацию вируса (Seto, Chang, 1969;

Compans et al., 1969; Webster, 1970), а одновалентные анти

тела не препятствуют освобождению вируса, хотя ингибируют

более 90% активности нейраминидазы (Becht et al., 1971).

Все эти данные, вместе взятые, позволяют предположить, что

двухвалентные антитела препятствуют освобождению вируса

путем связывания его с антигенами, присутствующими на по

верхности клетки, и путем ингибирования активности фер

мента. Роль нейраминидазы в освобождении вируса показа

ли также Palese и еоавт. (Г974), установившие, что этот фер

мент необходим для удаления нейр амиловой кислоты с ви

русной поверхности во избежание агрегации вирионов-потом-

ков на поверхности клетки.

IX. НЕПРАВИЛЬНЫЕ ФОРМЫ РАЗМНОЖЕНИЯ

А. АБОРТИВНОЕ РАЗМНОЖЕНИЕ, ЗАВИСЯЩЕЕ ОТ КЛЕТКИ-ХОЗЯИНА

Вирусы гриппа могут заражать широкий набор клеток-хозяев. Однако во многих из зараженных клеток выход инфекционного потомства или очень низок, или вообще не "Определяется, хотя вирусные компоненты можно обнаружить в обычных титрах. Этот тип зависящего от клетки-хозяина прерывания инфекционного цикла называют абортивной инфекцией. Такой абортивный инфекционный цикл первоначально наблюдали у мышей, зараженных в мозг ненейротропньши штаммами вируса гриппа (Schlesinger, 1953). Чем выше была вводимая доза вируса, тем -больше было количество вновь синтезированного гемагглютинина. Было описано несколько других систем клетка-хозяин-вирус гриппа А, в которых продуцировались только РНП-^антиген и гемагглютинин, но не инфекционный вирус. Во всех этих исследованных до сих лор системах РНП-антиген накапливался в ядре и не обна-

руживался с помощью флюоресцирующих антител в цитоплазме (Henle et al., 1955; Franklin, Breitenfeld, 1959; Ter Meulen, Love, 1967; Fraser, 1967).

Б. ФЕНОМЕН ФОН-МАГНУСА

В процессе серийных пассажей "вирусов гриппа при множественности выше, чем 1 (Barry, 1961), образуются увеличивающиеся -количества неполного вируса, выходящего из. клетки-хозяина (von Magnus, 1951, 1952). Эти вирусные частицы имеют поверхностную структуру, очень похожую на. структуру инфекционного вируса, являются иммуногенными: и вызывают гомологичную интерференцию. Они содержат меньше РНК и РНП-антигена, проявляют меньшую величину отношения инфекционности к гемагглютинирующей активности и содержат больше липидов, чем полные вирусные частицы (von Magnus, 1954; Isaacs, 1959; Pauker et al., 1959; Rott,. Schafer, 1961; Rott, Scholtissek, 1963).

При анализе РНК неполного вируса обнаружено, что вирусная РНК с относительно высокой [молекулярной массой или отсутствует или присутствует в них в уменьшенных количествах, тогда как количество РНК с низкой молекулярной массой увеличивается (Duesberg, 1968; Pons, Hirst, 1969; Nayak, 1969).

В клетках, зараженных вторым неразведенным пассажем вируса гриппа, .присутствует вся генетическая информация вируса, поскольку вкРНК, выделенная из этих «леток, способна превращать после гибридизации меченую РНК, выделенную из инфекционного вируса, в полностью РНК-азорези-стентную форму (Scholtissek, Rott, 1969b). Таким образом, увеличение.количества РНК с низкой молекулярной массой в неполных частицах.может шроисходить за счет РНК с большой молекулярной массой, которая может включаться в эти частицы в виде разрушенных и, следовательно, нефункцио-нирующих молекул. Эта идея поддерживается данными, что с жаждым неразведенным пассажем прежде ©сего падает способность продуцировать инфекционный вирус, после чего уменьшается синтез гемагглютинина, нейраминидазы и, наконец, РНП-антигена (Scholtissek et al., 1966).

Nayak (1972) установил, что в течение первого пассажа с высокой множественностью вирус, выходящий вначале, был полностью инфекционен и давал в сахарозном градиенте нормальную картину фрагментов РНК инфекционного вируса, тогда как вирус, выходящий позже, имел профиль РНК, типичный для неполного (фон-магнусовокого) вируса1.

Адсорбция
Знаменитое «H5N1» расшифровывается как «гемагглютинин пятого типа, нейраминидаза первого типа» - эти два белка торчат на поверхности вируса гриппа (на рис. 1 гемагглютинин зелененький, а нейраминидаза серенькая).

С помощью гемагглютинина вирус гриппа присоединяется к рецепторам на поверхности клеток. Изначальная цель вируса - клетки ресничного эпителия дыхательных путей, но любим мы его не за это: гемагглютинин может присоединяться к рецепторам многих других клеток, в том числе - эритроцитов. Если один вирус присоединится к двум (соседним) эритроцитам одновременно, то эритроциты склеятся! Отсюда и название белка - «крово-склеивающий».

рис. 1

Внедрение
Дура-клетка поглощает присоединившийся к ней вирус путем фагоцитоза - типа, ест его. Ну почему, почему дети всегда тянут в рот всякую гадость?! Впрочем, вирус оказывается внутри клетки пока что на правах еды, внутри фагоцитозного пузырька (на рис. 2 - «endosome»). Эндосома сливается с лизосомой, получается пищеварительная вакуоль, в нее из цитоплазмы закачиваются протоны для создания кислой среды (этот процесс показан на рис. 2) - еще чуть-чуть, и мы переварим вирус (со словами «белковая пища, какая разница»).

рис. 2

Раздевание
Но вирус готов к такому повороту событий:

рис. 3

• Гемагглютинин под действием кислой среды видоизменяется - его поверхность становится гидрофильной, и он (до этого присоединенный к рецептору на внутренней поверхности мембраны эндосомы, теперь) внедряется внутрь этой мембраны.
• Протоны, закачанные в эндосому, проходят сквозь специальные белки-каналы (белки М2, обозначены на рис. 1 и рис. 3) через липидную оболочку вируса и добираются до белковой оболочки вируса (на рис. 1 - кружочек из белых шариков - белков М1). Белковая оболочка из-за этого разрушается (на рис. 3 белки М1 разрушевшейся белковой оболочки обозначены как красные звёздочки).
• Липидная оболочка вируса (за счет проникающего действия гемагглютинина) сливается с (липидной) мембраной фагосомы; РНК вируса оказывается в цитоплазме клетки.

Репликация вируса
РНК вируса, вышедшая в цитоплазму, сама по себе совершенно безопасна.

• Белки на ней делать нельзя, потому что это минус-РНК (белки кодирует не она, а комплементарная ей плюс-цепь, которой пока что еще нет).
• РНК на ней делать тоже нельзя - в наших клетках вообще нет фермента, способного удваивать РНК.

«О-хо-хо, ничего-то у вас нет», - покачивая усатой головой, ворчит вирус гриппа, «но ничего, я принес все с собой». С собой вирус принес белки PB1, PB2 и PA, которые вместе образуют вирусную РНК-зависимую РНК-полимеразу - она может удваивать РНК. Но вот незадача! Любой полимеразе для начала работы нужен праймер, а его-то забывчивый грипп с собой и не захватил! Всё кончено?!

Спокойно, без паники! - С такими словами вся компания (8 вирусных РНК и 3 вирусных фермента) отправляется в ядро клетки. Там грипп получает полное обслуживание:

• праймерами для репликации вирусной РНК (для получения плюс-РНК) служат участки, отщепленные от клеточных РНК;
• процессинг: участки, которые служили праймерами для синтеза РНК - это были кэпы, так что модификация 5"-конца, считай, была проведена в самом начале; в конце синтеза происходит полиаденирование 3"-конца;
• сплайсинг: некоторые РНК вируса, содержащие информацию о двух белках, разрезаются на две части.

Таким образом синтезируются плюс-РНК, которые могут служить матрицами для синтеза вирусных белков и вирусных минус-РНК.

Дальше все просто: глупая клетка на собственных рибосомах из собственных аминокислот синтезирует белки вируса, в том числе РНК-зависимую РНК-полимеразу. Внутри ядра так же бодро производятся минус-РНК гриппа. Сборка вирусных частиц происходит в цитоплазме, на внутренней поверхности клеточной мембраны. Готовый вирус выходит из клетки путем экзоцитоза (почкования), нейраминидаза перекусывает последнюю ниточку, которая соединяет клетку и новорожденный вирус… Новая (злая) маленькая жизнь выходит в мир!

рис. 4

В ИРУСЫ ГРИППА: СОБЫТИЯ И ПРОГНОЗЫ

Д.К. Львов, А.Д. Забережный, Т.И. Алипер

Дмитрий Константинович Львов, академик РАМН, директор Научноисследовательского института вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН, заведующий кафедрой вирусологии Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова. Руководитель проектов 05-04-52136, 06-04-48822.

Алексей Дмитриевич Забережный, доктор биологических наук, заведующий лабораторией молекулярной диагностики того же института, руководитель отдела молекулярной биологии НПО «Нарвак».

Тарас Иванович Алипер, доктор биологических наук, заведующий лабораторией средств специфической профилактики вирусных болезней того же института, директор НПО «Нарвак».

Первую публикацию статьи см.: Природа. 2006. №6. С. 3–13.

Эпидемии гриппа происходят ежегодно и не воспринимаются как нечто экстраординарное. Поскольку заболевание вызывается уже знакомыми иммунной системе вирусами, она

с ними, как правило, справляется. Другое дело пандемии: в этом случае возбудитель гриппа - вирус с новыми антигенными и биологическими свойствами, молниеносно распространяющийся в мире, поражающий до четверти населения планеты и уносящий десятки миллионов жизней. Этим «прославились» пандемии прошлого века. Предвидеть их было невозможно, как, впрочем, нельзя назвать точное время наступления новой.

Однако сейчас благодаря постоянному слежению за циркулирующими среди людей, домашних и диких животных вирусами, а также знаниям, по лученным с помощью молекуляр- но-генетических методов, уже можно прогнозировать появление новых вариантов вируса с пандемическими наклонностями. В последние годы претендент на эту роль выявлен: изначально непатогенный вирус птиц H5N1 в конце 2003 г. вызвал эпизоотию гриппа среди домашних птиц, перешедшую в этом году в панзоотию. Этот вирус начал пора жать и других животных, в том числе и людей, но пока не может передаваться от человека к человеку. Чтобы он приобрел эту способность, достаточно замены всего одной аминокислоты в одном из вирусных белков.

Структуры вириона

Вирус гриппа устроен довольно просто: это сферической формы частица (вирион) диаметром около 0,13 мкм, в сердцевине, которой находится нуклеокапсид (молекула РНК, упакованная в оболочку из белка М1), окруженный липидной мембраной (рис.1). В эту мембрану погружены три белка - гемагглютинин, нейраминидаза и ионный канал (белок М2), играющие основную роль в инфекционном процессе.

Первым вступает в контакт с рецепторами клетки хозяина гемагглютинин. На поверхности вирусной оболочки он представлен в виде очень сложно устроенных тримеров. Каждый их мономер прочно заякорен в мембране и содержит две субъединицы - одна из них обеспечивает первичный кон такт с клеткой-мишенью, другая отвечает за слияние вирусной и клеточной мембран. В верхней части белка расположены участки, которые связываются с сиаловой кислотой, входящей в состав рецептора клетки хозяина.

Фермент нейраминидаза отщепляет концевые группы сиаловой кислоты клеточных рецепторов, в результате чего клетка теряет способность распознавать антиген, и вирус прони-

Б ИОЛОГИЯ И МЕДИЦИНСКАЯ НАУКА

Вирусы гриппа: события и прогнозы

кает в нее путем эндоцитоза - обычного способа доставки веществ в клетку. Кислая среда отпочковавшейся от клеточной мембраны эндосомы активирует ионный канал М2, который обеспечивает понижение рН внутри вирусной частицы, что приводит к разрушению белковой оболочки М1. Одновременно активируется гемагглютинин. Синтезируется он в виде предшественника, который в кислой среде переходит в зрелое состояние - расщепляется протеолитическими ферментами на две субъединицы, при этом спрятанный внутри тримера пептид слияния меняет конформацию, выходит на свободу, перемещается в верхний конец молекулы и внедряется в мембрану. Вирусная оболочка сливается с эндосомальной, образуется пора слияния, через которую в цитоплазму открывается путь для чужеродного генетического материала. Затем вирусная РНК проникает в клеточное ядро. В результате в клетке нарушаются процессы жизнедеятельности, и она сама, используя собственные ресурсы, начинает производить вирусные белки. Тут же происходит репликация вирусной РНК и сборка новых вирусных частиц, которые с помощью нейраминидазы высвобождаются из поврежденных клеток (при этом продукты их распада вызывают интоксикацию организма и лихорадочное состояние) и с кровотоком разносятся по всему организму.

Рис.1.Схема вириона вируса гриппа. Его липопротеидная оболочка покрыта шипиками из двух гликопротеидов - гемагглютинина и нейраминидазы. Внутри находится нуклеокапсид - молекула РНК, упакованная в оболочку из белка М1. Геном состоит из восьми фрагментов, из которых первые шесть кодируют по одному белку (гемагглютинин - HA, нейраминидазу - NA, субъединицы РНК-полимеразы - PB1, PB2, PA, нуклеопротеид

NP), а последние два гена - по два белка с уникальными последовательностями ами-

нокислот (матричные белки - M1, M2 и неструктурные белки - HS1, HS2).

Размножившийся вирус угнетает кроветворную и иммунную системы, повреждает эндотелий капилляров, что приводит к повышенной проницаемости сосудов и кровоизлияниям вплоть до отека мозга с летальным исходом. Но так происходит довольно редко, обычно включается иммунная система - сначала вовлекаются факторы врожденного (неспецифического) иммунитета, а через некоторое время начинают вырабатываться специфические антитела, освобождающие и при повторном заражении защищающие организм от вируса.

Отличительная особенность вирусов гриппа - высокая изменчивость антигенных свойств. Внутренние белки постоянны по своей структуре и определяют тип вируса (A, B и C). Поверхностные же антигены, напротив, гетерогенны и изменчивы, причем в большей сте-

Б ИОЛОГИЯ И МЕДИЦИНСКАЯ НАУКА

Вирусы гриппа: события и прогнозы

пени это касается гемагглютини на (H), который наряду с нейраминидазой (N) определяет подтип вируса (H1N1, H2N2, H3N2 и т.д.). Антигенная изменчивость поверхностных белков обусловлена двумя генетическими процессами - дрейфовыми и шифтовыми изменениями вирусного генома.

Дрейфовые изменения вызываются точечными мутациями в генах, кодирующих гемагглютинин и нейраминидазу, и приводят к незначительным изменениям в структуре этих белков. Как правило, такие изменения происходят в период между пандемиями у всех типов вирусов (А, В и С). В результате ежегодно возникают эпидемии, а не пандемии, так как защита от предыдущих контактов с вирусом сохраняется, хоть она и недостаточна.

Шифтовые изменения возникают после полной замены гена. Это возможно, поскольку геном вируса гриппа сегментирован - состоит из восьми фрагментов однонитчатой линейной РНК, кодирующих помимо гемагглютинина и нейраминидазы вирусоспецифический фермент (РНК-полимеразу, или транскриптазу, состоящую из трех субъединиц - белков PB1, PB2, PA), а также нуклеопротеид (NP), матриксные (М1 и М2) и неструктурные (NS1 и NS2) белки. При одновременном заражении клетки двумя разными штаммами сегменты их реплицирующихся геномов смешиваются в любых сочетаниях, поэтому новые вирионы содержат разные наборы генов, заимствованные от каждого из исходных вирусов. Такое комбинирование сегментов вирусной РНК называют генетической перетасовкой, или реассортацией, чтобы не путать с уже существующим термином - рекомбинацией, в ходе которой генетический материал перестраивается либо по механизму кроссинговера, либо в результате смены матрицы. Шифтовые изменения, как правило, затрагивают антигенную структуру гемагглютинина, реже - нейраминидазы. Таким образом, через нерегулярные интервалы времени (10- 40 лет) появляются вирусы с новыми антигенными и биологическими свойствами, в том числе и новые пандемические варианты .

Видовой барьер

Среди вирусов, способных вызывать чрезвычайные эпидемические ситуации, борьба с которыми на этапе их возникновения трудна или даже невозможна, особенно опасны вирусы гриппа А. Они характеризуются высокой антигенной гетерогенностью поверхностных белков и представлены, согласно номенклатуре, 16 подтипами гемагглютинина (H1-16) и 9 нейраминидазы (N1-9). Эти вирусы широко распространены в природе и могут поражать все виды птиц и некоторые виды млекопитающих (людей, лошадей, свиней, китов, тюленей и т.д.) . Заражение млекопитающих происходит в основном через дыхательные пути, птиц - через кишечник. Инфекция у них протекает, как правило, бессимптомно или в виде энтерита, что указывает на высокую степень взаимной адаптации вирусов гриппа и диких птиц, которых можно считать их естественными хозяевами. Вирус сохраняется в воде, при +22°С - до месяца, при +4°С и ниже - в течение более длительного времени (6-8 месяцев), поэтому вод- но-фекальный путь инфицирования - основной механизм поддержания постоянной циркуляции вируса гриппа в природе.

Несмотря на антигенную гетерогенность, вирусы со всеми известными сочетаниями поверхностных белков выделены только от диких птиц водного и околоводного комплексов - уток, чаек и т.д. (рис.2).

Среди других животных циркулируют лишь вирусы с определенным набором поверхностных белков: например, от людей до недавнего времени выделяли вирусы только трех подтипов гемагглютинина (Н1-Н3) и двух нейраминидазы (N1-N2). Все четыре пандемии ХХ в. были обусловлены новыми шифтовыми вариантами этих подтипов: «испанский грипп» в 1918 г. был вызван вирусом гриппа А подтипа H1N1, «азиатский грипп» в 1957 г. - H2N2, «гонконгский грипп» в 1968 г. - H3N2 и «русский грипп» в 1977 г. - H1N1. Все они - реассортанты вирусов гриппа птиц и человека .

Б ИОЛОГИЯ И МЕДИЦИНСКАЯ НАУКА

Вирусы гриппа: события и прогнозы

До недавнего времени считалось, что вирусы гриппа птиц не патогенны для людей и в случае заражения могут вызвать у них лишь конъюнктивит и легкое недомогание, в редких случаях - слабовыраженный респираторный синдром. Однако в 1997 г. вирусы Н5N1 вызвали чрезвычайно тяжелые формы заболевания среди людей в Гонконге - из 18 заболевших человек шестеро погибли, причем все они заразились от цыплят. Второй подобный эпизод произошел в феврале 2003 г. и тоже в Гонконге - из пяти инфицированных людей двое умерло. Вирусы H5N1 периодически выделяли от кур и других видов птиц (в том числе и диких) в локальных популяциях .

Рис.2. Схема циркуляции известных подтипов вирусов гриппа типа А.

Вирус серотипа H9N2, широко распространенный среди домашних птиц в Китае и других странах Азии, был обнаружен у пятерых китайцев в августе 1998 г., а спустя год в Гонконге у двух девочек с клиникой гриппоподобного заболевания. Примечательно, что все случаи заболеваний произошли независимо друг от друга, и передачи вирусов от человека к человеку не отмечено. В 1996 г. вирус гриппа птиц H7N7 был выделен от женщины, страдающей конъюнктивитом. Один случай в Нидерландах закончился смертью. Это только те случаи, которые официально зафиксированы, в реальности же вирусы гриппа птиц преодолевают видовой барьер, видимо, значительно чаще и начинают заражать не только человека, но и других животных (свиней, лошадей, китов, норок и т.д.). Известны случаи инфицирования домашних птиц (кур, индюков) вирусами гриппа, характерными для диких птиц, особенно водоплавающих .

Пока трудно уверенно судить обо всех факторах, ограничивающих круг хозяев вируса, и механизмах, влияющих на смену хозяина. Поиск такой ведется, и уже довольно давно, в различных исследовательских группах, в том числе и в нашем институте.

Первым под подозрение попал гемагглютинин, поскольку именно этот гликопротеид ответствен за распознавание рецепторов хозяйской клетки и участвует в слиянии вирусной оболочки с эндосомальной (по сути - части цитоплазматической оболочки клетки хозяина). Структура этих рецепторов отличается в зависимости от видового и тканевого происхождения клеток. Эти различия важны для ограничения перехода вирусов между видами и исследованы специально в связи с возникновением новых пандемических для человека вирусов .

Установлено, что рецепторы эпителиальных клеток дыхательного тракта человека помимо белка содержат углеводы - сиалоолигосахариды, у которых концевая сиаловая кислота (N-ацетилнейраминовая кислота) соединена с галактозой связью 2′-6′, а рецепторы клеток

Б ИОЛОГИЯ И МЕДИЦИНСКАЯ НАУКА

Вирусы гриппа: события и прогнозы

эпителия кишечника птиц - 2′-3′. Птичьи вирусы гриппа плохо репродуцируются в организме человека, потому что просто не могут связаться с рецепторами человека. В то же время муцины (по природе те же сложные гликопротеиды с сиаловой кислотой на конце), которые обязаны защищать легкие человека от микроорганизмов, содержат рецепторы именно с 2′-3′ галактозной связью. Таким образом, птичий вирус гриппа, случайно попавший в организм человека, проникнуть в клетки не может, так как на их поверхности нет специфических рецепторов, а распознающая активность рецепторов вирионов блокируются муцином, поэтому человеку в этом случае грозит лишь легкий насморк.

Но в таком случае, чем же объяснить возникновение пандемических шифтовых вариантов вируса? Ситуация немного прояснилась, когда стало известно, что клетки респираторного тракта свиньи несут оба типа рецепторов и соответственно могут заражаться вирусами гриппа как человека, так и птиц. Это означает, что свиньи потенциально могут служить промежуточным хозяином разных вирусов и идеальной ареной для их реассортации при смешанной инфекции.

Что касается гемагглютинина, то его способность распознавать клеточные рецепторы хозяина, как оказалось, в первую очередь связана со структурой рецептор-связывающего сайта (РСС). Так, у вирусов гриппа человека РСС содержит аминокислоты лейцин и серин в положениях 226 и 228 соответственно, а у птичьих вирусов в этих позициях находятся глутамин и глицин. Обнаружены и другие аминокислотные замены в РСС у разных животных, а это означает, что, хотя РСС консервативен и эволюционно устойчив, в нем все же есть вариабельные участки, влияющие на связывание с рецепторами (аффинитет) и специфичность .

Измениться РСС может после преодоления вирусом межвидового барьера, при этом вирусы гриппа птиц, например, могут приобрести способность распознавать рецепторы клеток человека. Доказательство того, что межвидовой барьер птица-человек может быть преодолен, - вспышка гриппа среди людей в Гонконге в 1997 г., вызванная птичьим вирусом H5N1.

Предполагается, что «привязанность» вируса к хозяину определяется не только особенностями гемагглютинина, но и другого поверхностного белка - нейраминидазы. Кроме того, есть основания считать, что в ограничении круга хозяев участвуют гены внутренних и неструктурных белков виру сов гриппа А. Однако говорить об этом пока рано, поскольку необходимо еще изучить вклад каждого гена и функции их продуктов. Как бы там ни было, важно понимать, что даже минимальные изменения в структуре вирусных белков, особенно гемагглютинина, могут вести к значительным изменениям не только в диапазоне хозяев вируса, но и степени его патогенности (вирулентности).

Вирулентность

Напомним, что для репродукции вируса в организме хозяина необходима активация предшественника молекулы гемагглютинина, при этом она расщепляется протеазами хозяина на две субъединицы. Протеолиз гемагглютининов низкопатогенных птичьих вирусов протекает в ограниченном числе типов клеток, поэтому вирус локализуется только в дыхательном или кишечном трактах. Так происходит при бессимптомной или средней тяжести инфекциях. Гемагглютинины высокопатогенных птичьих вирусов расщепляются в различных клетках и поэтому способны вызывать летальные системные инфекции, особенно у домашних птиц.

В различных лабораториях мира занялись исследованием генома высокопатогенных для людей штаммов вирусов гриппа (H5N1 и H7N7, выделенных в 1997-2004 гг.). Выяснилось, что эти вирусы содержат в сайте расщепления молекулы гемагглютинина несколько основных аминокислот, что и обеспечивает им высокую инфекционную активность и патогенность. В отличие от непатогенных или слабопатогенных вирусов, у которых этой аминокислотной последовательности нет, гемагглютинин высокопатогенных вирусов легко расщепляется не только трипсиноподобными протеазами, присутствующими в клетках респираторного тракта человека и кишечника птиц, но и фуриноподобными протеазами. Действуют они в комплексе

Б ИОЛОГИЯ И МЕДИЦИНСКАЯ НАУКА

Вирусы гриппа: события и прогнозы

с убиквитином, призванным помечать для протеаз белки, которые необходимо разрушить. Фуриноподобные протеазы синтезируются в разных тканях, что придает патогенным вирусам способность поражать разные системы и органы. Для превращения низкопатогенного вируса в высокопатогенный достаточно вставки даже одной основной аминокислоты в сайте протеолитического расщепления гемагглютинина .

Впоследствии это подтвердилось в опытах на мышах, инфицированных разными вариантами (выделенными в разные годы) вируса H5N1. Некоторые из них начали реплицироваться в мозге, печени, селезенке, клетках крови, вызывая 100%-ную гибель мышей на седьмыевосьмые сутки после заражения, тогда как другие вирусы оказались для мышей непатогенными и размножались только в легких. Вскоре и это объяснилось - у выделенных в 2004 г. вирусов H5N1 в сравнении с вирусами, полученными в 1997- 2003 гг., выявлены дополнительные мутации в гене гемагглютинина, что отразилось на изменении их антигеных свойств.

На патогенность вируса могут влиять изменения в структуре не только поверхностных, но и внутренних белков. Так, обнаружена мутация в положении 627 в белке PB2 у высокопатогенного для мышей штамма вируса гриппа H5N1. Именно эта мутация повлияла на различие в свойствах двух вирусов H5N1, изолированных в Гонконге, и как следствие - на результат инфекционного процесса. Кроме того, вирулентность этих вирусов гриппа связывают с особенностями строения неструктурного белка NS, в частности, с присутствием в его молекуле глутаминовой кислоты в 92 положении, что придает вирусам устойчивость к антивирусному действию интерферонов.

Безусловно, использование современных молекулярно-генетических методов в изучении вирусов гриппа постепенно проясняет их биологические свойства, однако не менее важны и традиционные методы, с помощью которых ведется мониторинг циркуляции вирусов гриппа среди людей, домашних и диких животных. Прогнозирование появления реассортантов с пандемическими наклонностями и разработка эффективных мер профилактики и борьбы с гриппом могут быть выработаны лишь на основе изучения экологии и эволюции возбудителей этого трудно предсказуемого и трудно контролируемого инфекционного заболевания. Такие исследования начаты более 35 лет назад Г. Лейвером в Австралии, Р. Вебстером в США, Д.К. Львовым в нашей стране, и ведутся они по сей день во всем мире.

События и прогнозы

Всестороннее изучение вирусов гриппа А инициировано Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) после пандемии в 1968 г., вызванной вирусом H3N2. В нашем институте установлено, что прародителем H3N2 был штамм, аналогичный вирусу H3N8, выделенному на Украине в 1963 г. от диких уток . Эти и другие данные послужили основанием для развития научного направления - экологии и эволюции вирусов гриппа А. Был создан Национальный центр по экологии вирусов гриппа А с сетью опорных баз, где получены новые данные, подтвердившие отсутствие принципиальных отличий между вирусами гриппа А человека и животных, т.е. наличия единого защищенного генофонда. Согласно этим данным, в 1980 г. создана классификация вирусов гриппа независимо от их происхождения. С тех пор каждому выделенному вирусу присваивается название, где отражены тип вируса, источник выделения, место и год выделения, а также подтип - например, А/утка/Украина/63(H3N8).

Основной задачей наших исследований в России было изучение эволюции вирусов гриппа А в процессе взаимодействия вирусных популяций с популяциями диких птиц и домашних животных и формирования штаммов с эпидемической потенцией. Для этого проводится мониторинг в ключевых точках Северной Евразии; выделены 14 из 16 известных виру-

В конце 2003 г., т.е. за три месяца до начала эпизоотии, вызванной вирусом птичьего гриппа Н5N1, в странах Юго-Восточной Азии один из авто ров этой статьи (Д.К. Львов) выступил на международном конгрессе по гриппу в Японии, сообщив о выделении этих вирусов

Б ИОЛОГИЯ И МЕДИЦИНСКАЯ НАУКА

Вирусы гриппа: события и прогнозы

от диких птиц в России - на Алтае и на юге Приморья. По молекулярно-генетическим данным, эти штаммы отнесены к группе низкопатогенных. Тогда, по аналогии с более ранними наблюдениями, был сделан первый прогноз о возможности их интродукции с перелетными птицами в птичьи хозяйства Юго-Восточной Азии, где они через какое-то время могли бы превратиться в высокопатогенные с панзоотической и пандемической потенциями. Повидимому, так и произошло. Вспыхнувшая эпизоотия за короткий срок охватила 10 стран. За прошедшее время погибло и забито более 150 млн. кур и уток. По данным ВОЗ, к концу марта 2006 г. заразились уже 185 человек, 104 из которых погибли. Эпизоотия продолжается, причем вирусы проникли и в свиные популяции, что вызывает особую тревогу. Возможно, мир стоит на пороге эпидемиологической катастрофы: реассортанты могут сформироваться в любой момент при одновременном заражении свиней птичьим вирусом Н5 и вирусами гриппа человека Н1 или Н3, циркулирующими во всем мире.

Был сделан и второй прогноз: в случае заражения в местах зимовок диких птиц высокопатогенными штаммами возрастает риск их занесения на территорию России, особенно в Сибирь и на Дальний Восток, во время весенних миграций. А затем произошло то, что и должно было произойти. В середине июля 2005 г. в населенных пунктах Новосибирской обл., расположенных в пределах озерной северной лесостепи Барабинской низменности, выявлена эпизоотия среди домашних птиц с летальностью свыше 90% и быстрым распространением.

Были собраны материалы от домашних и диких птиц, обитавших в непосредственной близости от места эпизоотии. Используя клеточные линии CПЭВ и MDCK (этот нестандартный метод проходит сейчас патентование), мы выделили шесть штаммов H5N1 от домашних птиц и чомги (Podiceps cris tatus ), причем концентрации вируса в тканях были очень высокими. С приоритетом от 8 августа 2005 г. эти штаммы депонированы в Государственную коллекцию вирусов, а данные секвенирования их полноразмерного генома заложены в GenBank с приоритетом от 5 сентября 2005 г. . Сайт протеолитического нарезания гемагглютинина всех полученных штаммов содержит аминокислотную последовательность PQGERRRKKRGLF, характерную для высокопатогенных вирусов гриппа птиц. Нуклеотидные последовательности генов гемагглютинина всех анализируемых вирусов домашних птиц оказались полностью идентичными, но отличаются от штамма, выделенного от дикой птицы (чомги), правда, всего двумя нуклеотидными заменами (рис.3). Филогенетический анализ выявил высокий уровень гомологии гемагглютининов западносибирских штаммов со штаммами, изолированными весной того же года от горного гуся (Anser indicus ) на оз. Кукунор в северозападной провинции Цинхай (КНР). Это полностью подтвердилось при анализе остальных семи генов .

Идентичность генетических характеристик изолированных штаммов доказывает непосредственную связь между вирусами, циркулирующими в популяциях диких и домашних птиц. Вместе с тем обнаруженные в 2005 г. штаммы вируса гриппа H5N1 существенно отличаются от штаммов этого вируса, выделенных в предыдущие годы, в том числе и от полученного из Англии штамма А/Вьетнам/1194/2004(H5N1), предлагаемого у нас в стране для производства вакцины. Очевидно, что, по крайней мере, для ветеринар ной вакцины может быть использован только штамм из Государственной коллекции вирусов, соответствующий по антигенным свойствам циркулирующему в России вирусу.

Выделенный нами штамм, депонированный в Государственную коллекцию вирусов, уже используется для крупномасштабного производства вакцины на ФГУП «Ставропольская птицефабрика». Вакцинируются домашние птицы в Южном федеральном округе. К 15 июня 2006 г. планировалось произвести 15 млн. доз вакцины с дальнейшим расширением производства.

К слову, в условиях пандемии, когда надо быстро наладить производство вакцины, целесообразно, на наш взгляд, использовать в качестве субстрата линии клеток, в которых вирус гриппа быстро накапливается в высоких концентрациях. Этот недавно разработанный метод обладает существенными преимуществами по сравнению с традиционным, в котором исполь-

Б ИОЛОГИЯ И МЕДИЦИНСКАЯ НАУКА

Вирусы гриппа: события и прогнозы

зуются куриные эмбрионы: при сохранении всех антигенных доменов гемагглютинина культуральная вакцина исключает появление осложнений, связанных с куриным белком. Это особенно важно при производстве вакцины для людей. Вот только надо знать, какой штамм следует использовать для иммунизации людей. Это будет зависеть от антигенной характеристики возникшего пандемичного варианта. Возможно, он будет отличаться от того, что есть сейчас. В любом случае абсолютно недопустимо использование живой вакцины. Генетическое взаимодействие вакцинных и полевых вирусов может привести к возникновению реассортантов с непредсказуемыми последствиями.

Рис.3. Степень родства нуклеотидных последовательностей гена гемагглютинина вариантов вируса гриппа А подтипа Н5, изолированных от диких и домашних птиц в разных странах в последние 10 лет. Жирным шрифтом выделены высокопатогенные штаммы H5N1 цинхайско-новосибирской группы вирусов.

Анализ генома выделенных нами штаммов выявил ряд особенностей, связанных с биологическими свойствами. Помимо аминокислотной последовательности сайта протеолитического расщепления гемагглютинина, определяющей высокий уровень патогенности вируса, обнаружены делеции в положении 49-68 в нейраминидазе (генотип Z), что указывает на повышенный тропизм выделенных нами вирусов к домашним птицам и потенциальную патогенность для людей. Глутаминовая кислота в 92-й позиции белка NS1 определяет устойчивость вируса к действию интерферона и повышенную вирулентность для свиней. Лизин в позиции 627 белка PB2 объясняет способность изучаемых штаммов к репродукции в различных линиях клеток млекопитающих. Выявленные свойства проникшего на территорию России вируса свидетельствуют о его высокой патогенности в отношении домашних птиц и людей .

Наличие серина, а не аспарагина, в 31-й позиции M2 указывает на чувствительность вируса к ремантадину, что полностью совпало с данными прямого изучения влияния противовирусных препаратов на репродукцию вируса. Для этих целей мы также использовали клеточные линии и выяснили, что для профилактики и раннего лечения гриппа одинаково эффективны и могут быть использованы как дорогостоящие зарубежные препараты - например, тамифлю, так и относительно дешевые отечественные, которые есть в аптеках, - ремантадин,

Б ИОЛОГИЯ И МЕДИЦИНСКАЯ НАУКА

Вирусы гриппа: события и прогнозы

виразол (при внутривенном и аэрозольном применении), арбидол . К сожалению, производство этих препаратов сейчас в стране отсутствует или недостаточно, и необходимо срочно создать их стратегические запасы.

Каким же образом и когда проник высокопатогенный вирус гриппа Н5N1 на территорию России, и как будут развиваться дальнейшие события?

Рис.4. Пути распространения вируса гриппа Н5N1 в популяциях диких и домашних птиц. Низкопатогенные вирусы гриппа (НПВГ), выделенные от диких и домашних птиц в севе- ро-восточной области Алтайского края в 1991 г. и на юге Приморского края в 2001 г., очевидно, были предшественниками вспышки гриппа в Гонконге в 1997 г. и эпизоотий на юго-востоке Азии в 2003-2005 гг., а также на северо-западе Китая в 2005 г. Став высокопатогенными (ВПВГ), эти вирусы проникли во время весенней миграции диких птиц в Западную Сибирь, где летом 2005 г. вызвали вспышку гриппа среди домашних птиц. В период миграции птиц водного и околоводного комплекса произошло дальнейшее распространение ВПВГ на север и запад Евразии, а зимой 2006 г. эти вирусы уже были обнаружены в Африке. Толстыми стрелками обозначено заражение вирусом гриппа от диких

птиц к домашним и наоборот.

Сначала низкопатогенные штаммы, циркулирующие в Сибири и на Дальнем Востоке среди диких птиц, были занесены во время осенних миграций в страны Юго-Восточной Азии (рис.4). Превратившись там в высокопатогенные, они с дикими же птицами весной 2005 г. проникли в Западную Сибирь и резко активизировались в период появления птенцов. Высокопатогенные штаммы разлетелись с птицами в места гнездовий на территории более 10 млн.

км2 . После попадания вируса в популяции домашних птиц произошел взрыв эпизоотии. Это всерьез и надолго.

Третий прогноз заключался в том, что когда осенью птицы полетят обратно в места зимовок через густонаселенные территории России и других стран, они вновь разнесут вирус.

Б ИОЛОГИЯ И МЕДИЦИНСКАЯ НАУКА

Вирусы гриппа: события и прогнозы

Так и произошло. Осенью 2005 г. вирус уже долетел до большинства европейских стран, обнаружен он и в Турции, Крыму, Иране, Азербайджане, Грузии, Индии, а также в Африке. А у нас добрался до Тулы, Калмыкии и дельты Волги, где вспышка гриппа в популяции лебедя шипуна (Cygnusolor ) возникла в декабре 2005 г. после короткой остановки пролетающих северных уток - хохлатых чернетей (Aythya fuligula ). Изолированные от лебедей штаммы, по данным их молекулярно-генетического анализа, также относятся к цинхайскозападносибирской группе вирусов. За полгода циркуляции среди диких птиц штаммы сохранили генотип и не потеряли высокой патогенности.

Четвертый прогноз наиболее тревожный. Вирусом загрязнены многие водоемы в местах гнездовий и на путях пролета, и сохранится он там до весны. Каждый естественный водоем, куда попали фекалии зараженных птиц, превращается в «мину замедленного действия». Это можно сравнить с вовлечением в таежный пожар торфяников. Весной зараженные и здоровые пти цы вернутся обратно и полетят через эти «минные поля», поэтому события летом 2006 г. могут быть значительно более грозными, чем в прошедшем се зоне. Подтверждение тому - уже в марте лавинообразное ухудшение ситуации в Европе, Азии и Африке. Это - уже панзоотия. А когда высокопатогенные штаммы, циркулирующие весной среди диких птиц, вернутся к слабопатогенным, сколько времени займет процесс их реассортации, предсказать невозможно - месяцы или годы. Ясно, что это предмет приоритетного изучения, от которого зависит развитие событий в обозримом будущем.

Что касается пандемического вируса, то он может возникнуть и у нас после заражения свиней вирусами человека и птиц. Но скорее попадет к нам из Китая, где возможности трансформации реассортанта особенно велики, учитывая активность эпизоотического процесса и огромный восприимчивый контингент среди населения. Появиться у нас пандемический вирус может в любой момент - для этого достаточно лишь одной аминокислотной замены в РСС гемагглютинина, в результате вирус начнет распознавать рецепторы клеток человека и соответственно начнет передаваться от человека к человеку.

Что, с нашей точки зрения, следовало бы делать уже сейчас на государственном уровне, сформулировано в таблице. Мы же собираемся особое внимание уделить изучению дальнейшей эволюции высокопатогенных штаммов, поразивших популяции диких птиц. Ключевое значение в этом имеют экосистемы на территории России. Планируем продолжить мониторинг в европейской части страны, в Сибири и на Дальнем Востоке, а также, возможно, в некоторых сопредельных странах.

В последние пять лет наши исследования проводились совместно с охотоведами, орнитологами, сотрудниками федеральных служб фитоветеринарного и санэпиднадзора Новосибирской, Астраханской, Иркутской областей, Приморского края, Биробиджана, республик Калмыкии и Бурятии. Все это проходило в рамках федеральных программ «Защита от патогенов», «Разработка средств и методов противодействия биотерроризму», «Грипп А свиней и птиц: взаимодействие популяций».